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技術服務 >技術資料 >基因敲除和基因下調
基因敲除和基因下調

RNAi和基因敲除怎么選?

對于高等真核生物,RNAi介導的Knockdown是減少細胞中目的基因表達產物的最常用方法。然而,RNAi無法完全去除目的基因。

RNAi作用機制:由外源性導入、病毒激活及轉座子活動等途徑引入的dsRNA,井DICER酶處理后,反義siRNA與體內一些酶(外切酶、內切酶、解旋酶等)結合形成RNA誘導的沉默復合物(RISC),RISC與mRNA進行特異性結合,在結合部位切割mRNA,mRNA隨即降解,除此之外,siRNA還可作為引物與靶RNA結合并在RNA聚合酶(RdRP)作用下合成更多新的dsRNA,新的dsRNA再由DICER切割產生大量次級siRNA,最終將mRNA完全降解。

在生物體內,RNAi介導的基因沉默原理分為mRNA降解或翻譯抑制,最終導致在不改變遺傳密碼的情況下,轉錄后基因表達量下調。一些功能RNA或蛋白質的翻譯水平會保持不變或降低。因此,用以減少基因功能的RNAi技術隸屬于基因下調(Knockdown)方法,該方法無法完全去除基因功能。

與此相反,基因組編輯改變遺傳密碼,引起基因敲除(Knockout),以致完全缺失基因功能。這一敲除過程起始于染色體上雙鏈斷裂(DSB)的產生。目前,最熱門的基因編輯技術就是CRISPR-Cas9了,它的作用機理是crRNA(CRISPR-derived RNA)與tracrRNA(trans-activating RNA)結合形成的復合物能特異性識別靶基因序列,并引導Cas9核酸內切酶在靶定位點剪切雙鏈DNA,而通過人工設計這兩種 RNA,可以改造形成具有引導作用的sgRNA (short guide RNA ),足以引導 Cas9 對 DNA 的定點切割。真核細胞對雙鏈斷裂的應答機制有兩種:第一,非同源末端連接(NHEJ),兩個游離的染色體末端重連。然而,NHEJ較容易出錯,常常導致插入或缺失以致基因斷裂或敲除;第二,細胞可通過同源重組修復HDR,這一修復機制為研究者提供了更多的基因敲除選擇。例如:研究者可人為地引入敲除、特異突變引入、定點突變等。


那么,比較RNAi介導的基因下調和基因組編輯介導的基因敲除,哪種方法更好呢?這取決于具體實驗目的。

很多人會將這兩種方法混淆,將基因編輯當成“knockdown”,其原因是:在基因組編輯方法出現并運用于實驗研究之前的許多年里,最實用且最常用的減少細胞中目的基因功能的方法是RNAi,近十年前RNAi方法的運用已經非常成熟。因此,研究者們已經習慣于使用“基因下調(Knockdown)”這個詞。而近幾年隨著CRISPR的流行,也越來越多的人將RNAi當成“基因敲除”。

通常,如果不需要改變遺傳密碼時,RNAi介導的基因下調比基因組編輯更適用。例如,研究人員想要暫時減少基因功能時,可將siRNA瞬時轉染到細胞中。多次傳代后,siRNA丟失,基因功能恢復正常;再者,shRNA介導的基因下調不需要分離單克隆,從而減少了實驗步驟,節省了大量時間和成本。最后,有時候完全去除基因功能可能會傷害細胞本身,但部分去除基因功能則不會。

但是,如果要在染色體上產生一個真正無效的等位基因,那么采用基因組編輯方法更佳。此外,研究人員可采用基因組編輯技術引入點突變或敲除,再者,利用該方法,研究者可添加融合標簽到目的基因處并使其在特定位點表達,而實現這些實驗目的都依賴于基因組編輯技術。


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