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技術服務 >技術資料 >CRISPR/Cas9
CRISPR/Cas9

CRISPR/Cas9技術

1.     CRISPR/Cas9系統簡介

CRISPR/Cas 是細菌和古細菌在長期演化過程中形成的一種適應性免疫防御,可用來對抗入侵的病毒及外源 DNA。CRISPR/Cas 系統通過將入侵噬菌體和質粒 DNA 的片段整合到 CRISPR 中,并利用相應的 CRISPR RNAs(crRNAs)來指導同源序列的降解,從而提供免疫性。

此系統的工作原理是 crRNA( CRISPR-derived RNA )通過堿基配對與 tracrRNA (trans-activating RNA )結合形成 tracrRNA/crRNA 復合物,此復合物引導核酸酶 Cas9 蛋白在與 crRNA 配對的序列靶位點剪切雙鏈 DNA。而通過人工設計這兩種 RNA,可以改造形成具有引導作用的sgRNA (short guide RNA ),足以引導 Cas9 對 DNA 的定點切割。

2.     CRISPR/Cas系統結構

CRISPR/Cas系統的組成主要包括:由不連續的重復序列(repeat)與長度相似的間區序列S(spacers)間隔排列而成的CRISPR簇,前導序列L(leader)以及一系列CRISPR相關蛋白基因Cas。


Cas蛋白是一種雙鏈DNA核酸酶,能在guide RNA引導下對靶位點進行切割。

3.     CRISPR/Cas系統的作用機理

3.1CRISPR的高度可變的間隔區的獲得

首先識別入侵的核酸和掃描外源DNA潛在的PAM(NGG序列),將臨近的PAM的序列作為候選protospacer;然后再CRISPR基因座的5’端合成重復序列;最后新的間隔序列整合到兩個重復序列之間。

3.2 CRISPR基因座的表達(包括轉錄和轉錄后的成熟加工)

當該噬菌體再次入侵細菌時,CRISPR簇首先轉錄為長的crRNA前體,然后逐步被加工成小的成熟的crRNA。

3.3 CRISPR/Cas系統活性的發揮或者是對外源遺傳物質的干擾

crRNA結合相關的Cas蛋白后,形成crRNA-Cas蛋白復合體,通過堿基互補配對精確地與目標DNA相結合,隨后Cas蛋白對目標DNA進行斷裂和降解。



4. CRISPR-Cas系統的應用

4.1 CRISPR-Cas介導的基因組編輯技術

?  基因組編輯技術是一種可以在基因組水平上對DNA序列進行改造的遺傳操作技術。

?  這種技術的原理是構建一個人工內切酶,在預定的基因組位置切斷DNA,切斷的DNA在被細胞內的DNA修復系統修復過程中會產生突變,從而達到定點改造基因組的目的。

?  通過修復途徑,基因組編輯技術可以實現兩種基因改造,即無模板的隨即修復(NHEJ)和有模板的重組修復(HDR)

?  NHEJ包括:1.篩選插入或缺失非3的倍數個堿基突變的純合子

2.大片段刪除,包括lncRNA,miRNA刪除

? HDR包括:1.基因敲入

2.定點突變

4.1.1        NHEJKNOCK OUT)——篩選插入或缺失非3的倍數個堿基突變的純合子

?  針對目的基因分別設計3個sgRNA;

?  構建成sgRNA質粒;

?  病毒包裝,細胞感染,切割效果鑒定;

?  單克隆測序驗證,發貨。




4.1.2        NHEJKNOCK OUT)——大片段刪除,包括lncRNAmiRNA刪除

    ?   針對目的基因兩端分別設計3個sgRNA;

    ?   每端單獨篩選出切割效果最好的sgRNA;

    ?  將兩端切割效果最好的sgRNA構建成雙sgRNA質粒;

    ?   病毒包裝,細胞感染,切割效果鑒定;

    ?   單克隆測序驗證,發貨。

4.1.3        NHEJ敲除穩轉株構建




4.2 CRISPR-Cas介導的SAM激活

?  dead Cas9即dCas9

內切活性喪失的Cas9,dCas9在gRNA的導向下仍能靶向內源基因組的特定位點。

?  內源性激活基因表達

dCas9與轉錄激活域 (vp64)進行融合。VP64與p65及HSF1協同作用,增強內源基因的轉錄。

? sgRNA的設計

sgRNA引導復合物靶向內源基因轉錄起始位點(Transcriptional Start Site (TSS))的-200bp處,上調基因表達。



4.3 CRISPR-Cas介導的其他應用

4.3.1    基因修飾-甲基化/去甲基化


4.3.2    轉錄抑制



5.     GeCKOv2 human library

GeCKO文庫是CRISPR gRNA的混合文庫,可以在人的基因組內敲除任何基因及非表達的基因。每條gRNA克隆到優化過的慢病毒載體中以實現高效率地轉染原代細胞或培養細胞。GeCKO文庫應以較低的MOI值轉導細胞,以保證每個細胞進入不超過1條gRNA。轉染完成后在進行文庫篩選之前,應對細胞進行NGS深度測序,以評估gRNA在細胞中的表現。文庫篩選后,還需進行第二輪NGS測序并數據分析,以鑒定在篩選過程中缺失或富集的gRNA。通過GeCKO文庫篩選找到真正的陽性克隆,鑒定哪些基因相對應的gRNA是被富集的。



針對人類基因組的每個基因,GeCKO文庫的設計包含:6條單鏈gRNA(sgRNA)以及針對每個miRNA的4條sgRNA,及1000條非靶向性的對照sgRNAs。

這些gRNA分布在每個基因超過3-4個組成型表達的外顯子上,以此將脫靶效應降至很低。每個文庫均包括兩個子文庫A和B,每個子文庫都分別包含針對每個基因的3個唯一的sgRNA;僅A文庫包含可靶向1864 個miRNAs中任意一個miRNA的4條sgRNA。


二代測序分析:

?  對測序的原始reads進行質控和數據統計。

?  與客戶指定的reference library進行比較分析,統計出測序reads數與reference中的gene ID的對應關系數據。

? 對于不同的樣品進行比較分析,按照一定規則進行normalize,比較不同樣品之間的差異,統計出差異倍數。

?  統計出同一Gene ID出現次數情況,找到出現0次和某個閾值次數以上的基因。

?  其他基于以上統計結果開展的一些分析工作。


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