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技術服務 >細胞生物學 >免疫共沉淀(CO-IP)
免疫共沉淀(CO-IP)

簡介:

免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation)是以抗體和抗原之間的專一性作用為基礎的用于研究蛋白質相互作用的經典方法。是確定兩種蛋白質在完整細胞內生理性相互作用的有效方法。其原理是:當細胞在非變性條件下被裂解時,完整細胞內存在的許多蛋白質-蛋白質間的相互作用被保留了下來。如果用蛋白質X的抗體免疫沉淀X,那么與X在體內結合的蛋白質Y也能沉淀下來。這種方法常用于測定兩種目標蛋白質是否在體內結合;也可用于確定一種特定蛋白質的新的作用搭檔。

 

優點:

(1)相互作用的蛋白質都是經翻譯后修飾的,處于天然狀態;

(2)蛋白的相互作用是在自然狀態下進行的,可以避免人為的影響;

(3)可以分離得到天然狀態的相互作用蛋白復合物。

 

缺點:

(1)可能檢測不到低親和力和瞬間的蛋白質-蛋白質相互作用;

(2)兩種蛋白質的結合可能不是直接結合,而可能有第三者在中間起橋梁作用;

(3)必須在實驗前預測目的蛋白是什么,以選擇最后檢測的抗體,所以,若預測不正確,實驗就得不到結果,方法本身具有冒險性。


實驗流程:

(1)轉染后24-48 h 可收獲細胞,加入適量細胞裂解緩沖液(含蛋白酶抑制劑),冰上裂解30min, 細胞裂解液于4°C, 最大轉速離心30 min后取上清;

(2)取少量裂解液以備Western blot分析,剩余裂解液加1μg相應的抗體加入到細胞裂解液,4°C緩慢搖晃孵育過夜;

(3)取10μl protein A 瓊脂糖珠,用適量裂解緩沖液洗3 次,每次3,000 rpm離心3 min;

(4)將預處理過的10μl protein A 瓊脂糖珠加入到和抗體孵育過夜的細胞裂解液中4°C緩慢搖晃孵育2-4h,使抗體與protein A瓊脂糖珠偶連;

(5)免疫沉淀反應后,在4°C 以3,000 rpm 速度離心3 min,將瓊脂糖珠離心至管底;將上清小心吸去,瓊脂糖珠用1ml裂解緩沖液洗3-4次;最后加入15μl的2×SDS 上樣緩沖液,沸水煮5分鐘;

(6)SDS-PAGE, Western blotting或質譜儀分析。


注意事項:

(1)細胞裂解采用溫和的裂解條件,不能破壞細胞內存在的所有蛋白質-蛋白質相互作用,多采用非離子變性劑(NP40或Triton X-100)。每種細胞的裂解條件是不一樣的,通過經驗確定。不能用高濃度的變性劑(0.2%SDS),細胞裂解液中要加各種酶抑制劑,如商品化的 cocktailer。

(2)使用明確的抗體,可以將幾種抗體共同使用

(3)使用對照抗體:

單克隆抗體:正常小鼠的IgG或另一類單抗

兔多克隆抗體:正常兔IgG


在免疫共沉淀實驗中要保證實驗結果的真實性,應注意以下幾點:

(1) 確保共沉淀的蛋白是由所加入的抗體沉淀得到的,而并非外源非特異蛋白,單克隆抗體的使用有助于避免污染的發生;

(2) 要確保抗體的特異性,即在不表達抗原的細胞溶解物中添加抗體后不會引起共沉淀;

(3) 確定蛋白間的相互作用是發生在細胞中,而不是由于細胞的溶解才發生的,這需要進行蛋白質的定位來確定。


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