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技術服務 >蛋白表達與純化服務 >真核細胞蛋白的表達 >桿狀病毒-昆蟲蛋白表達及純化
桿狀病毒-昆蟲蛋白表達及純化

服務描述:

目前常用的桿狀病毒表達載體有AcMNPV和BmNPV兩種,我們選用的家蠶桿狀病毒表達系統(BmNPV)是基于家蠶體內系統非常適合大規模制備外源蛋白,并且成本較低、方便、高效,而且翻譯后加工也與天然蛋白極其相似。我們結合桿狀病毒的轉染與表達特性,以家蠶幼蟲和蛹為宿主大量表達外源蛋白,為您提供快速,滿意的蛋白表達服務。

 

服務內容:

服務步驟

主要內容

交付內容

交付時間

目的基因全基因合成

1. GenBank中尋找目的蛋白的cDNA序列。

2. 根據選用的表達系統對cDNA進行密碼子及mRNA二級結構的優化。

3. 合成設計好的基因序列。

目的基因(連接在T載體或其它常規克隆載體上)及測序報告。

2

目的基因亞克隆到pFastBac供體質粒

1. 培養并抽提含有目的基因的載體質粒。

2. 將目的基因亞克隆到pFastBac供體載體上。

3. 測序驗證構建質粒的準確性。

4. 通過中抽獲得重組的質粒DNA

正確構建的重組表達質粒,含重組質粒的DH5α菌株及測序報告。

2-3

制備重組桿狀病毒Bacmid DNA

1. 將重組的pFastBac供體質粒轉化到大腸桿菌DH10Bac感受態菌株中。

2. 通過抗生素平板篩選出含有重組Bacmid的菌株。

3. 抽提質粒獲得重組的桿狀病毒Bacmid DNA

重組桿狀病毒Bacmid DNA,含重組質粒的DH10Bac菌株

2

轉染昆蟲細胞Sf-9

1. 利用轉染試劑將重組Bacmid質粒轉入昆蟲細胞Sf-9

2. 收集成熟的重組桿狀病毒并檢測病毒的滴度。3. 通過多次感染提高病毒的滴度,并擴增病毒數量。

4. 通過SDS-PAGEWestern-blot檢測目的蛋白表達情況。

高滴度重組桿狀病毒,病毒滴度及蛋白表達檢測結果(如果轉染不成功,則不收取費用。如果沒有檢測到目的蛋白表達,則只收取50%實驗費用)。

3

目的蛋白表達及純化

1. 培養500ml昆蟲細胞至對數期,然后加入適量病毒感染細胞并表達目的蛋白。

2. 收集含有目的蛋白的部分(細胞或培養上清)。

3. 通過親和,離子交換,疏水及凝膠過濾等多種層析方法純化表達的重組蛋白。

4. 通過SDS-PAGE電泳檢測每步結果并控制最終產品質量。

5. 通過Western-blot驗證目的蛋白正確性。

6. 可提供表達細胞株:Sf-9Sf-9 MimicHigh Five

純化好的目的蛋白0.1~2mg及純化報告。可按客戶要求提供含純化標簽(Tag)或切除純化標簽(Tag)的最終蛋白,純度可達80%以上。

2-3

目的蛋白的再加工及詳細檢測

1. 內毒素去除,除菌,凍干等進一步加工。

2. 通過HPLC,質譜等方法詳細檢測目的蛋白的質量。

加工后的終產品及相關實驗和檢測報告。

2-3

大規模制備

按照小試工藝放大生產規模,制備客戶需要的合格蛋白產品。

合格的目的蛋白及服務報告。

協商

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