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技術服務 >蛋白表達與純化服務 >真核細胞蛋白的表達 >哺乳動物細胞蛋白表達及純化
哺乳動物細胞蛋白表達及純化

服務描述:

哺乳動物細胞是表達具有天然活性蛋白的最佳宿主。其優勢在于能正確有效地識別真核蛋白的合成、加工和分泌信號,識別和去除基因中的內含子,再經剪切加工成為成熟的mRNA,能準確地完成糖基化、磷酸化,形成鏈內和鏈間二硫鍵及蛋白水解等翻譯后加工過程,因而產生的完整抗體和天然抗體一樣,具有生物學活性,既可識別抗原又可激活補體系統。哺乳動物細胞易被重組的DNA轉染,經過篩選可得到轉化的細胞,具有遺傳穩定性和可重復性.表達的產物分泌到培養基中易于純化等優勢。因此,利用哺乳動物細胞表達外源蛋白已經廣泛應于生物醫藥的多個領域。我們公司可根據您的樣品特點選擇在不同的哺乳動物細胞中進行表達,為您提供與天然蛋白結構完全相同的重組蛋白。

 

服務內容:

服務步驟

主要內容

交付內容

交付時間

目的基因全基因合成

1. GenBank中尋找目的蛋白的cDNA序列。

2. 根據選用的表達系統對cDNA進行密碼子及mRNA二級結構的優化。

3. 合成設計好的基因序列。

目的基因(連接在T載體或其它常規克隆載體上)及測序報告。

2

 

目的基因亞克隆到哺乳動物細胞表達載體

1. 培養并抽提含有目的基因的載體質粒。

2. 將目的基因亞克隆到真核表達載體上。

3. 測序驗證構建質粒的準確性。

4. 通過中抽獲得重組的質粒DNA

正確構建的重組表達質粒,含重組質粒的DH5α菌株及測序報告。

2

小量轉染并通過Western-blot檢測表達

1. 利用轉染試劑將重組質粒轉入合適的哺乳動物細胞中。

2. 從轉染后24h72h,每12h取樣一次,通過SDS-PAGEWestern-blot檢測目的蛋白表達情況。

3. 可提供表達細胞株有:293293TNIH/3T3COS-7CHO

目的蛋白表達結果

2

目的蛋白表達及純化

1. 培養500ml哺乳動物細胞,然后將重組質粒轉染到細胞中,通過瞬時表達產生目的蛋白。

2. 收集含有目的蛋白的部分(細胞或培養上清)。

3. 通過親和,離子交換,疏水及凝膠過濾等多種層析方法純化表達的重組蛋白。

4. 通過SDS-PAGE電泳檢測每步結果并控制最終產品質量。

5. 通過Western-blot驗證目的蛋白正確性。

純化好的目的蛋白及純化報告。可按客戶要求提供含純化標簽(Tag)或切除純化標簽(Tag)的最終蛋白,純度可達80%以上。

3-4

目的蛋白的再加工及詳細檢測

1. 內毒素去除,除菌,凍干等進一步加工。

2. 通過HPLC,質譜等方法詳細檢測目的蛋白的質量。通過親和,離子交換,疏水及凝膠過濾等多種 層析方法純化表達的重組蛋白。

加工后的終產品及相關實驗和檢測報告。

2-3

篩選穩定高表達細胞株

1. 將轉染后的哺乳動物細胞團轉到96孔細胞培養板內,然后加入含有MTX的培養基。

2. 當細胞長到大約2/3孔時,取培養上清檢測表達。

3. 挑出高表達的細胞團用于下一輪篩選,并在下一次細胞培養基中提高MTX的濃度。

4. 重復加壓篩選過程,提高細胞株的表達量直到獲得合適的穩定表達株。

5. 通過SDS-PAGE電泳檢測每步表達結果。

6. 通過Western-blot驗證目標蛋白正確性。

穩定的高表達細胞株及篩選報告

6-8

大規模制備

按照小試工藝放大生產規模,制備客戶需要的合格蛋白產品。

合格的目的蛋白及服務報告。

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