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技術服務 >技術資料 >慢病毒包裝流程介紹
慢病毒包裝流程介紹

實驗流程

制備編碼慢病毒顆粒的重組病毒質粒及其輔助包裝原件載體質粒,重組質粒載體和輔助質粒載體分別進行高純度無內毒素抽提,使用HG transgene reagent進行共轉染 293T細胞,轉染后8h 更換為完全培養基,培養48h后,收集富含慢病毒顆粒的細胞上清液,對其濃縮后得到高滴度的慢病毒濃縮液,在293T細胞中測定并標定病毒滴度。在一定滴度范圍內的慢病毒顆粒可以滿足大部分體內體外實驗需求。

實驗材料

細胞株

293T,慢病毒的包裝細胞,為貼壁依賴型成上皮樣細胞,生長培養基為 DMEM(含 10% FBS)。貼壁細胞經培養生長增殖形成單層細胞。

菌株

大腸桿菌菌株 DH5α。用于擴增慢病毒載體和輔助包裝載體質粒。

病毒載體

pGMLV-Lu載體圖譜:(具體結構請參考“報告基因慢病毒說明書”)

DNA溶液的制備:以Qiagen公司的質粒抽提試劑盒提取慢病毒包裝系統中各種質粒DNA,質粒DNA溶于除菌的TE中,以紫外光吸收法測定其濃度及純度,保證所提質粒DNA 的 A260/A280在1.8~2.0之間。 

試劑

試劑名稱

試劑來源

臺盼蘭

上海前塵生物

胎牛血清

GIBICO

DMSO

sigma

DMEM

GIBICO

胰酶

GIBICO

HG transgene reagent

 

儀器

儀器名稱

儀器來源

熒光顯微鏡

奧林巴斯

CO2培養箱

Thermo

生物安全柜

Thermo

離心超濾裝置

MILLIPORE

病毒的包裝

1. 293T細胞的培養

1)從液氮罐中取出凍存的細胞并迅速放入37℃熱水中,輕輕晃動使細胞快速解凍。然后用70%的酒精擦拭細胞凍存管,拿入超凈臺中操作。以后所有步驟都應注意無菌操作。

2) 將凍存的細胞轉移到15ml離心管中,后加4mL提前預熱的培養基并輕輕混勻。1000 rpm離心5min。小心棄掉上清,并用適量培養基重懸細胞。

3)輕輕將細胞吹打散開,并轉移到無菌的細胞培養皿中,置于37℃,CO2培養箱中培養。

2. 慢病毒包裝與收集

1)   293T細胞分盤

轉染前一天,將15cm培養皿中已經長好的細胞以合適比例傳代到10cm培養皿中,當細胞長到70%~80%時準備轉染。

2)   轉染前換液

轉染前1~2 h 將需要轉染的細胞換新鮮的培養基,12ml/10cm皿,注意:293T細胞貼壁性不是很好,換液時應小心滴加盡量避免沖起細胞。

3)   轉染

取無菌的1.5ml EP管或15ml離心管,轉染體系按下表:

無血清的DMEM

1ml

質粒

10μg

Lentivirus Mix

10μl10μg

HG transgene reagent

60μl

混勻后,室溫放置15min-20min后,均勻滴加到提前換過液的培養皿中,后置于CO2培養箱中培養。

4)   加Enhancing buffer

轉染10~12h后,均勻滴加100×Enhancing buffer促進轉染,120μl/皿。

5)   換液

轉染18~20h后,小心吸掉細胞培養液棄于盛有消毒液的廢液杯中(注意:此時培養基中已含有少量的病毒,必須經處理后才能丟棄,所用的移液槍頭等必須經消毒液浸泡至少20min后才能丟棄),然后加15ml無血清的DMEM(或加含血清的DMEM,具體的按客戶要求)繼續培養。

6)  病毒收集

換液48h后,吸取細胞上清液于50ml離心管,4℃,4500g離心5min,上清液用0.45μm濾器過濾后轉移到新的離心管中,最后將濾液分批轉移到centrifugal filter devices 中,4℃,4500g,離心10min,棄下層的液體于盛有消毒液的廢液杯中,最后一次4℃,4500g,離心20min,此時可見濾器上層中有200~250μl液體即為病毒濃縮液(如換液用的是加了FBS的DMEM,則病毒濃縮液可達到400~500μl)。

7)  病毒分裝與保存

將病毒以40~50μl分裝,后保存于-80℃。


慢病毒使用方法請參考附件“慢病毒使用操作手冊”。

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