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技術服務 >技術資料 >腺病毒包裝流程介紹
腺病毒包裝流程介紹

實驗流程簡介(AdMax包裝系統)

用構建的腺病毒表達載體和骨架質粒共轉染293細胞,包裝病毒,收集病毒原液,超濾濃縮得到病毒濃縮液。

首先將構建成功的腺病毒重組質粒和包裝質粒采用Qiagen公司的質粒抽提試劑盒提取。所得的質粒質粒溶于無菌的TE中,以紫外光吸收法測定其濃度及純度,保證所提質粒DNA A260/A2801.82.0之間。使用HG-Trans293TMtransfection reagent將構建好的病毒質粒及其輔助包裝原件質粒共轉染進293細胞,轉染10~12h后加Enhancing buffer,接著8h后更換新鮮培養基,繼續培養7-15天后,細胞脫落后收集富含病毒顆粒的細胞及上清液,得到p1代病毒,經過幾輪擴增后,對得到的病毒進行濃縮后得到高滴度的病毒濃縮液。在一定滴度范圍內的病毒顆粒可以滿足大部分體內、體外實驗需求。


實驗材料

細胞株

293,腺病毒的包裝細胞,為貼壁依賴型成上皮樣細胞,生長培養基為DMEM( 10% FBS)

菌株

大腸桿菌菌株DH5α。用于擴增腺病毒載體和輔助包裝質粒。

吉滿生物常用腺病毒載體圖譜

 

腺病毒基因過表達載體


腺病毒基因干擾載體

 

試劑

試劑名稱

試劑來源

臺盼蘭

上海前塵生物

胎牛血清

GIBICO

DMSO

Sigma

DMEM

GIBICO

胰酶

GIBICO

HG transgene reagent

 

 

儀器

儀器名稱

儀器來源

熒光顯微鏡

奧林巴斯

CO2培養箱

Thermo

生物安全柜

Thermo

離心超濾裝置

MILLIPORE

 

腺病毒包裝流程

1.       293細胞的培養

1)從液氮罐中取出凍存的細胞并迅速放入37℃熱水中,輕輕晃動使細胞快速解凍。然后用70%的酒精擦拭細胞凍存管,拿入超凈臺中操作。以后所有步驟都應注意無菌操作。

2) 將凍存的細胞轉移到15ml離心管中,后加4mL提前預熱的培養基并輕輕混勻。1000 rpm離心5min。小心棄掉上清,并用適量培養基重懸細胞。

3)輕輕將細胞吹打散開,并轉移到無菌的細胞培養皿中,置于37℃,CO2培養箱中培養。

2.       腺病毒包裝與收集

1) 293細胞分盤

轉染前一天,將已經長好的細胞以合適的比例傳代到6 cm培養皿中,當細胞長到70%~80%時準備轉染。

2) 轉染前換液

轉染前1~2 h 將需要轉染的細胞換新鮮的培養基。

3) 轉染

取無菌的1.5ml EP管或15ml離心管,轉染體系按下表:

DMEM

0.5ml

過表達質粒

2μg

pBHG(delta)E1,3 cre

4μg

HG transgene reagent

18μl

 

混勻后,室溫放置15min-20min后,均勻滴加到提前換過液的培養皿中,后置于CO2培養箱中培養。

4  Enhancing buffer

轉染10~12h后,均勻滴加100×Enhancing buffer促進轉染,120μl/皿。

5  換液

轉染18~20h后,小心吸掉細胞培養液棄于盛有消毒液的廢液杯中(注意:此時培養基中已含有少量的病毒,必須經處理后才能丟棄,所用的移液槍頭等必須經消毒液浸泡至少20min后才能丟棄),然后加15ml無血清的DMEM(或加含血清的DMEM,具體的按客戶要求)繼續培養。

6) 病毒收集

病毒收集前要觀察病毒空斑是否形成,感染后7天左右可以在顯微鏡下看到小的空斑,一般在1021天內形成,收集細胞及上清,反復凍融三次收集病毒,以此病毒為P1代病毒。

7)病毒擴增

P1代腺病毒感染293細胞,連續進行三代感染,至P4代進行腺病毒的大量擴增,待空斑形成后收集病毒并對病毒進行體外純化和濃縮。

8) 病毒純化

病毒純化采用CsCl密度梯度離心-透析聯用法純化病毒,CsCl梯度的制備方法如下:加入2.0ml密度為1.40g/mlCsCl溶液,然后緩慢加入3.0ml密度為1.30g/mlCsCl溶液,再加入5ml的病毒懸浮,20000rpm,室溫離心2小時。

收集密度在1.30g/ml1.40g/ml之間的病毒條帶至透析袋中(透析袋使用前用10mMEDTANa2煮沸10min)。在透析緩沖液(50g蔗糖,10ml 1M Tris-HClPH8.02ml 1M MgCl2定容至1L)中,4℃攪拌透析過夜,中間換一次透析液。收集病毒,測定病毒滴度。

9)病毒重懸和保存

適量PBS重懸病毒沉淀,一周內使用則置于4度冰箱保存,如需長時間存放需置于-80度甚至液氮保存。

 

腺病毒使用方法請參考附件“腺病毒使用操作手冊”。

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